Игра продолжается вскоре после событий Assassin's Creed, где, в 2012, Дезмонд Майлс (Нолан Норт) пленник «Абстерго Индастриз», которые используют его для дешифрования его генетической памяти о его предке-убийце Альтаире в машине «Анимус». «Абстерго», современный эквивалент рыцарей Тамплиеров, использовали Дезмонда, чтобы определить местонахождение мощного артефакта, именуемого «Частицей Эдема». Используя Орлиное зрение, полученного в результате «эффекта просачивания» (из-за частого нахождения в Анимусе), Дезмонд стал видеть сообщения и символы, написанные кровью на его стене спальни предыдущим испытуемым, именуемым «Объект 16». Люси Стиллман (Кристен Белл), сотрудник Абстерго и член современных ассасинов, освобождает Дезмонда и прячет его в секретном укрытии к двум другим ассасинам, Шону Хастингсу (Дэнни Уоллес) и Ребекке Крэйн (Элиза Шнайдер). С их аналогом «Анимус 2.0», они приглашают Дезмонда помочь им использовать его генетическую память о его предке, Эцио Аудиторе да Фиренце, по двум причинам: тренировать Дезмонда навыкам ассасина с помощью эффекта просачивания, и найти другие Частицы Эдема.

Эцио, проживающий в Италии в эпоху Возрождения в конце XV столетия, посчитал свою семью во Флоренции жертвами политического заговора, повлёкшего за собой казнь его отца и двух братьев. Инструкции его отца приводят Эцио к сундуку, в котором находилось снаряжение ассасина. Дядя Эцио Марио позволяет ему, его матери и сестре укрыться в его загородном особняке, где и обучает Эцио искусству боя. Затем Марио выводит на предателей его семьи, и Эцио идёт по следу из подсказок, ведущих от Флоренции до Сан Джиминьяно, Форли, Венеции, и в конечном счёте к Риму.

По ходу сюжета раскрывается множество тайн, связанных с первой частью и личностями Альтаира и Дезмонда Майлса.

По прохождению надо будет находить печати Ассасинов, которые в конечном счёте можно будет поставить на пьедесталы и получить броню Альтаира.

Кроме того увлекательным есть факт, что имя Эцио Аудиторе да Фиренце имеет интересный перевод - Смотрящий из Флоренции. Также, как и интересный перевод был у имени Альтаир ибн Ла-Ахад - Летящий, Сын Никого.